Experimento 9.0. Desnaturalización de proteínas.
12 de julio de 2000
OBJETIVOS
Objetivo experimental
Observar el comportamiento de una proteína globular hidrosoluble en solución acuosa en función de la fuerza iónica.
Tiempo requerido
Alrededor de tres horas.
Conocimientos necesarios
Composición química de las proteínas; propiedades físicas y químicas de los polipéptidos; clasificación bioquímica de las proteínas.
Antecedentes teóricos
La solubilidad de las proteínas es sensible a la composición y al pH del medio, así como a la presencia de otros solventes. Asimismo, las proteínas presentan comportamiento de electrolitos simples en solución, por lo que son susceptibles a la concentración iónica del medio.
Las proteínas globulares hidrosolubles muestran un mínimo de solubilidad, aunque el pH al que ello ocurre varía de una proteína a otra, siendo éste un pH isoeléctrico, definido como el valor de pH al que la molécula no posee carga eléctrica y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. En estas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas de proteínas vecinas tienden a coalescer y precipitar.
Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las proteínas globulares. A baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas, fenómeno que recibe el nombre de solubilización por salado. Las sales de los iones divalentes, MgCl2 y el (NH4)2SO4, son mucho más eficaces en la solubilización de las proteínas que las sales de iones monovalentes, NaCl, NH4Cl y KCl. La capacidad de las sales neutras para influir en la solubilidad de las proteínas está en función de su fuerza iónica, que constituye una medida, tanto de la concentración como del número de las cargas eléctricas existentes en los cationes y los aniones aportados por la sal. La fuerza iónica es proporcional a cizi2, por lo que al agregar la constante de proporcionalidad nuestra ecuación queda como
I = ½ Si cizi2
donde,
I = fuerza iónica
ci = concentración iónica
zi = número de carga
Material necesario
1. Por grupo
Balanza analítica 1
Hielo
2. Por equipo
Agitador magnético 1
Anillo de hierro de 10 cm. 1
Bisturí o navaja o cuchillo 1
Botella lavadora 1
Cristalizadores de 10 cm 2
Electrodo para H+ 1
Electrodo de referencia 1
Espátula 1
Mechero de Bunsen 1
Manguera de hule 1
Parrilla magnética 1
Pinzas para soporte 2
Potenciómetro 1
Probeta de 50 ml 1
Solución estándar pH 7 1
Solución estándar pH 4 1
Soportes universales 2
Termómetro -10 a 200 °C 2
Vasos de precipitado 100 ml 12
Vasos de precipitado 50 ml 4
Soluciones
1. Por grupo
2. Por equipo
Agua destilada 50 ml
Cloroformo 50 ml
Cloruro de magnesio 0.3 mmoles
Cloruro de sodio 0.3 mmoles
Etanol absoluto 50 ml
Hidróxido de amonio 50 ml
Huevos 6
Limón (jugo) 1
Tetracloruro de carbono 50 ml
PROCEDIMIENTO. Verificado
Equipo de protección.
Ojos.
Anteojos de policarbonato o monogógles sin ventilación.
Piel.
Guantes de neopreno para ácidos y solventes orgánicos.
Guantes térmicos para materiales calientes.
Ropa de algodón.
Respiratorio.
Respirador para ácidos y solventes orgánicos (Código amarillo o negro).
Entendido
Maneje los ácidos en campana para vapores.
Maneje los solventes orgánicos en campana para vapores.
No respire los vapores.
Precauciones especiales. Verificado
Baño de ojos disponible.
Regadera de seguridad disponible.
Entendido
Lave abundantemente después de usar los reactivos.
Método
1. Preparación de soluciones.
Con la probeta graduada se miden 30 ml de los siguientes reactivos líquidos y se colocan en vasos de precipitados de 100 ml:
Agua destilada
Cloroformo
Etanol absoluto
Hidróxido de amonio
Tetracloruro de carbono
Con la espátula se toman 0.3 mmoles, pesando en vasos de precipitados de 50 ml con la balanza analítica, de las siguientes sales:
Cloruro de magnesio
Cloruro de sodio
2. Experimento.
Precipitación de proteína.
Se toma un vaso de precipitados limpio y los cinco vasos con reactivos líquidos.
Se toma el limón, se corta a la mitad y se exprime el jugo en el vaso de precipitados limpio.
Se toma otro vaso de precipitados limpio. Este vaso se coloca sobre la parrilla magnética y se le introduce el agitador magnético.
Se toma otro vaso de precipitados limpio.
Se toman cuatro huevos. Se cascan y se coloca la mitad de la clara de cada huevo en sendos vasos de precipitados, desechando las yemas.
La clara de uno de los vasos limpios se deja como testigo o control.
Se toman dos vasos de precipitados limpios.
Se casca un huevo y se coloca la mitad de la clara cada uno de los vasos limpios.
En uno de los vasos se agregan los 0.3 mmoles de cloruro de magnesio, mientras que en el otro se agregan los 0.3 mmoles de cloruro de sodio.
En un cristalizador se forma una cama de hielo y se le agrega cloruro de sodio hasta que la temperatura descienda a -4 °C.
Se coloca el cristalizador sobre un soporte universal.
Se coloca el mechero de Bunsen sobre el soporte universal.
Se coloca el anillo de hierro en el soporte universal sobre el mechero de Bunsen.
Otro cristalizador se coloca sobre el anillo de hierro y se le pone un poco de agua para formar un baño de María.
Se toman dos vasos de precipitados limpios.
Se casca un huevo y se coloca la mitad de la clara en cada vaso.
Se embebe uno de los vasos de precipitados con clara en la cama de hielo, se le introduce un termómetro sujeto al soporte y se hace girar el vaso sobre la cama de hielo para enfriarlo. Se registran la temperatura y el tiempo.
El otro vaso se coloca sobre el baño de María y se le introduce el termómetro sujeto al soporte universal. Se registran la temperatura y el tiempo.
Forma de desechar. Verificado
Incinere los residuos orgánicos en una campana con filtro y trampa.
Discusión
Explique el comportamiento de la proteína en función de las variables estudiadas a partir de los resultados.
Referencias
Chang, R. 1977. Physical chemistry with applications to biological systems. Macmillan Publ. Co., Inc., New York, N.Y.
Lehninger, A.L. 1975. Biochemistry. 2nd ed. Worth Publ., Inc., New York, N.Y.
Tinoco Jr., I., Sauer, K. y Wang, J.C. 1978. Physical Chemistry. Prentice Hall, Inc., Englewood Cliff, N.J.