OBJETIVO.

Objetivo didáctico.

Objetivo experimental.

• Estudiar la translocación de diversos cationes catalizada por ionóforos para determinar la secuencia de afinidad iónica de acarreadores modelo.

Tiempo requerido.

Aproximadamente dos horas.

Conocimientos necesarios.

Manejo del espectrofotómetro.

Uso de indicadores metalocrómicos.

Química de coordinación.

Las membranas biológicas poseen componentes que facilitan la difusión de iones y moléculas necesarios para sus funciones metabólicas. Estos componentes son capaces de interactuar con uno o varios solutos en uno de los lados de la membrana, para movilizarlos y liberarlos al otro extremo de la misma. Es esta característica la que le confiere a las membranas biológicas la propiedad de seleccionar las especies químicas que la atraviesan, por lo que se comportan como barreras semipermeables.

Un modelo general para el flujo o translocación de cationes metálicos mediado por acarreadores iónicos tipo nigericina, se puede formular como el producto de varios factores:

Ji µ f(pH½, pKa, ai, aei, E°i, ri, qi, [A]m, FA, µA, Ks, CpL, DL, µm, Kd)

El valor del pH ambiental adyacente a la membrana (pH½) afecta la disociación de los grupos ionizable del acarreador, lo que depende de su constante de acidez (pKa). La alta concentración del catión (ai) induce su unión a la molécula ligante en la interfase membrana-agua; ésta depende de factores intrínsecos del metal, como su afinidad electrónica (aei), potencial de reducción (E°i), radio (ri) y carga iónicas (qi). Si la concentración del acarreador en la membrana ([A]m) es suficiente, es posible que varias moléculas se aglomeren en función de su flexibilidad (FA) y polaridad (µA), alrededor del catión en función del pH interfasial originando un oligómero conductor. Una vez formado el complejo acarreador-metal, lo que depende de su estabilidad (Ks), éste debe solubilizarse en la fase orgánica (CpL) para poder difundir (DL) a favor del gradiente del catión, a través de la matriz hasta el otro extremo de la membrana; en este caso es importante la polaridad del medio membranal (µm). Cuando el complejo se encuentra en la interfase, la molécula se disocia (Kd) del catión que se solubiliza en el medio acuoso. Así, el acarreador libre difunde de vuelta para completar un ciclo de transporte.

La constante de extracción de los complejos acarreador-catión se determinan en un sistema de dos fases, en el que se tiene inicialmente solubilizado al acarreador en la fase orgánica y al catión (en forma de sal) en la fase acuosa.

El equilibrio en la extracción de un par iónico, por efecto del acarreador iónico se describe por la reacción

[L]_o + [M⁺]_a + [A^-]_{a \}=====^\ [LM⁺A^-]_o

donde, L, M⁺ y A^- representan al acarreador iónico (ligando), al ion metálico y al anión, respectivamente, mientras que los subíndices a y o denotan las fases acuosa y orgánica.

De esta manera, la constante de extracción K_ex se define como la constante de equilibrio de la reacción anterior:

    [LM+A-]o
Kex = ---------------
    [L]o [M+]a [A-]a

Agitador magnético chico 1

Agitador magnético grande 1

Espátula 1

Matraces volumétricos de 50 ml 1

Matraces volumétricos de 100 ml 1

Matraces volumétricos de 250 ml 1

Parrilla magnética 1

Vasos de precipitados de 50 ml 1

Vasos de precipitados de 100 ml 1

Vasos de precipitados de 250 ml 1

Botella lavadora 1

Celdas de vidrio 2

Electrodo combinado de pH 1

Espectrofotómetro 1

Gradilla 1

Mezcladora 1

Pipetas Pasteur con bulbo 6

Pipetas serológicas de 1 ml 3

Pipetas serológicas de 5 ml 3

Pipetas serológicas de 10 ml 3

Potenciómetro 1

Probeta graduada de 50 ml 1

Trampa de vacío 1

Tubos de ensaye de 15 ml 6

Vasos de precipitado de 25 ml 5

Agua desionizada o destilada.

Acarreador iónico modelo 0.1 mM (50 ml en un solvente orgánico).

Indicador metalocrómico 0.1 mM (250 ml en agua desionizada).

Cloruro catiónico MCl₂ 0.1 mM (100 ml en agua desionizada).

Solventes orgánicos de baja polaridad:

SOLVENTE m (Debyes) e

Diluciones de MCl₂ 0.05 mM, 0.01 mM, 0.005 mM y 0.001 mM.

PROCEDIMIENTO. Verificado

Se prepara una solución 0.1 mM del acarreador iónico en el solvente orgánico de baja polaridad escogido.

Se prepara una solución de MCl₂ 0.1 mM.

A partir de la solución madre de MCl₂ 0.1 mM se realizan diluciones sucesivas para elaborar una curva de calibración y para realizar el experimento a diferentes concentraciones de catión: 0.05 mM, 0.01 mM, 0.005 mM y 0.001 mM.

Se preparan 250 ml de indicador metalocrómico 0.1 mM en agua desionizada.

Para obtener los valores de la K_ex del catión catalizado por el acarreador se realizan las reacciones en sistemas de mesofases, y se hacen las mediciones cuando el sistema llega al equilibrio.

En 5 tubos de ensayo de 15 ml se colocan 5 ml de la fase orgánica que contiene al acarreador en solución (en una concentración del orden de 0.1 mM); en el tubo No. 6 se colocan 5 ml de solvente puro (sin acarreador) como control. En seguida, se ponen en contacto con 5 ml de la solución acuosa del par iónico a cuantificar, a concentraciones 0.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM, 0.005 mM y 0.001 mM, respectivamente en cada tubo; en el tubo No. 6 se colocan 5 ml de cloruro de catión 0.1 mM.

Los tubos de ensayo se agitan vigorosamente durante 5 min. por medio de una mezcladora. Posteriormente se dejan reposar durante media hora para que se separen las fases.

Las fases se separan cuidadosamente por medio de una pipeta Pasteur (si la fase acuosa queda en la parte inferior del tubo, se elimina la fase orgánica por medio de vacío) y se toman 2.5 ml de la fase acuosa para cuantificar la concentración de catión remanente.

3. Curva de calibración de M²⁺.

De cada una de las soluciones de 0.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM, 0.005 mM y 0.001 mM, se toman 2.5 ml y se le añaden 2.5 ml de indicador metalocrómico 100 µM, se agitan. Cada una de ellas se coloca en la celda para medir su absorbencia (A) a l_máx lineal, en el espectrofotómetro.

4. Cuantificación de M²⁺.

Para medir el M²⁺ remanente en la fase acuosa, se toman 2.5 ml de indicador metalocrómico 0.1 mM y 2.5 ml de cada muestra, se agitan; se colocan en la celda y se mide su Al_máx lineal, en el espectrofotómetro.

Cuantificación del complejo acarreador-metal. Una vez que se conoce la relación estequiométrica del complejo acarreador:metal, es posible determinar la concentración de ligando unido al metal en la fase orgánica de los experimentos de mesofases. Se determina directamente la concentración de metal presente en dicha fase y se calcula entonces la concentración de complejo acarreador-catión, de acuerdo a su estequiometría.

Dado que la concentración de complejo ligando-metal-anión [LM⁺A^-]_o es la única incógnita de la ecuación para el cálculo de la constante de extracción, esta puede, entonces, calcularse directamente.

Trace una curva de concentración de catión añadido vs catión unido.

Calcule los parámetros cinéticos de la unión acarreador-catión.

Interprete la forma de la curva de unión acarreador-catión.

En la Tabla I se enlistan los solventes seleccionados, con sus respectivos valores de constante dieléctrica (e) y momento dipolar (m) ; estos parámetros representan las características fisicoquímicas que se analizarán en los experimentos. La Tabla I también etablece los valores de las propiedades mencionadas, para el caso del agua, como punto de referencia.

Para seleccionar los solventes orgánicos a emplearse en estos experimentos se consideran características: deben ser inmiscibles en agua y deben presentar una buena solubilización para el acarreador en estudio.

Los acarreadores iónicos pueden ser:

Dibenzo-18-corona-6 (DB18C6) 360.4 25

Lasalócido A 612.8 50

Valinomicina 1111.3 30