Propiedades fisicoquímicas de las enzimas.

Propiedades fisicoquímicas de las enzimas



OBJETIVO.

Objetivo didáctico.
Identificar algunas propiedades fisicoquímicas de las enzimas como proteínas.

Objetivo experimental. Someter una muestra cruda de una proteasa a acción térmica, ácida y alcalina para determinar sus efectos sobre la actividad catalítica de la enzima y de este modo, determinar su naturaleza proteica.

INTRODUCCION.
Desnaturalización.
La mayoría de las proteínas mantienen su actividad biológica sólo dentro de un intervalo muy limitado de temperaturas y pH. La exposición de proteínas globulares hidrosolubles a temperatura alta o valores extremos de pH por cortos periodos provoca que sufran cambios físicos, disminuya su solubilidad y pierdan su actividad nativa. Este proceso se conoce como desnaturalización y hasta este punto no involucra la ruptura de enlaces dentro de la estructura química de la proteína. Si los cambios en pH o temperatura no son demasiado grandes, la desnaturalización es reversible. La desnaturalización se debe a la modificación de la estructura tridimensional natural o nativa de la proteína, por la influencia de las propiedades fisicoquímicas del medio sobre los grupos funcionales químicos del polipéptido.
Las enzimas, por su naturaleza proteica, tienen un valor de pH y temperatura característicos a los cuales muestran su actividad máxima. Por arriba o por debajo de dichos valores de pH o temperatura, la actividad disminuye.
La gelatina es una proteína que viene del tejido conjuntivo de las pezuñas, huesos, tendones, ligamentos y cartílago de animales. La gelatina vegetal, el agar, se obtiene a partir de algas marinas. La gelatina se disuelve en agua caliente y se endurece con el frío. Es posible agregarle todo tipo de fruta para hacer postres deliciosos, pero se nos advierte en el paquete no agregar piña natural. ¿Por qué?

Enzimas
Las enzimas son proteínas que realizan la catálisis de las reacciones químicas en los seres vivos.
Las piñas, al igual que otras frutas y vegetales, contienen enzimas que rompen los enlaces de las proteínas, produciendo pequeños fragmentos de polipéptidos; estas enzimas reciben el nombre de proteasas. Si se pone piña natural o fresca en la gelatina, la proteasa estará digiriendo las moléculas proteicas de la gelatina y evitará que cuaje, por lo que permanece líquida. El calentamiento a alta temperatura o cocimiento desnaturaliza la enzima y evita que la proteasa siga catalizando la hidrólisis de los enlaces de la gelatina.

REACTIVOS Y SUSTANCIAS PREVIOS A LA SESION.
Preparación de soluciones.
Realice los cálculos para preparar 25 ml de las soluciones en agua:

Ácido clorhídrico 0.1 M.
Hidróxido de sodio 0.1 M.

MATERIALES Y EQUIPOS.

___Agitador magnético ½" x 5/16" 1
___Anillo de hierro 1
___Balanza analítica 1
___Balanza granataria 1
___Bisturí 1
___Botella lavadora de 500 ml 1
___Cajas de Petri 5
___Celdas cilíndricas de vidrio de 5 ml 2
___Colorímetro 1
___Espátula 1
___Gradilla 1
___Manguera de hule 1
___Mano para mortero 1
___Matraces volumétricos de 25 ml 3
___Matraz volumétrico de 50 ml 1
___Mechero de Bunsen 1
___Mortero 1
___Parrilla magnética 1
___Pipetas Pasteur 2
___Pipetas serológicas de 10 ml 2
___Pipetas serológicas de 5 ml 2
___Pipetas serológicas de 1 ml 4
___Probeta graduada de 50 ml 4
___Propipeta 1
___Vaso de precipitados de 100 ml 2
___Rejilla de asbesto 1
___Soporte universal 1
___Termómetro -10 a 200 °C 1
___Tubos de ensayo de 20 x 150 mm 15
___Vasos de precipitado de 50 ml 6
___Vaso de precipitado de 100 ml 6
___Vaso de precipitado de 500 ml 1

REACTIVOS Y SUSTANCIAS.

___Ácido clorhídrico concentrado. (MW 36.47 g/mol).
___Agua destilada. (MW 18.016 g/mol).
___Bicarbonato de sodio. (MW 84.00 g/mol).
___Hidróxido de sodio. (MW 40.01 g/mol).
___n-butanol.
___Solución patrón de caseína: 10 mg/ml.
___Si es necesario, agregue solución concentrada de NaOH para disolver.
___1 kiwi.
___2 limones.

___Reactivo de Biuret: 1.5 g de sulfato cúprico penta-hidratado
___ 6.0 g de tartrato doble de Na y K tetra-hidratado.
___Forma de preparar: Disolver en 500 ml de agua destilada.
___ Agregar 300 ml de solución de NaOH al 10% libre de carbonatos.
___ Aforar a 1000 ml.
PROCEDIMIENTO.

Equipo de protección.
Ojos.
___Anteojos de policarbonato o monogógles.

Piel.
___Guantes de neopreno.
___Ropa de algodón.

Respiratorio.
Respirador con filtro para ácidos (Código amarillo).
Maneje los ácidos y solventes orgánicos en campana para vapores.
No respire los vapores.

Precauciones especiales.
___Baño de ojos disponible.
___Regadera de seguridad disponible.
___Extinguidor de polvo químico, CO2 o gas halón (Tipo ABC).
___Lave abundantemente después de usar los reactivos.

Experimento.
___Colóquese ropa de algodón para protección (bata).
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los interruptores de luz del laboratorio estén encendidos.
___Revise que los extractores de aire estén encendidos.
Preparación de soluciones.
___Revise que el Agua destilada esté sobre la mesa.
___Revise que el Bicarbonato de sodio esté sobre la mesa.
___Revise que el Hidróxido de sodio esté sobre la mesa.
___Revise que el Sulfato cúprico esté sobre la mesa.
___Revise que el Tartrato de sodio y potasio esté sobre la mesa.
___Colóquese los guantes de neopreno.
___Lave el material con agua corriente y detergente.
___Enjuague el material con agua destilada.
___Seque el material con franela o con papel absorbente.
___Seque los guantes de látex con franela o con papel absorbente.
___Colóquese anteojos de policarbonato o monogógles.
___Arme el soporte universal con el anillo de hierro y la rejilla de asbesto.
___Conecte el mechero de Bunsen a la llave de gas.
___En un vaso de precipitado de 250 ml hierva con el mechero 200 ml de agua destilada.
Preparación de soluciones
___Tome un vaso de precipitados de 100 ml.
___Etiquete el vaso de 100 ml con el nombre bicarbonato 10 %.
___Ajuste la balanza a 0.0 g.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % sobre la balanza.
___Tare el vaso bicarbonato 10 %.
___Destape el frasco de bicarbonato de sodio.
___Tome un espátula.
___Pese 10 g de bicarbonato de sodio en el vaso bicarbonato 10 %.
___Tape el frasco de bicarbonato de sodio.
___Limpie el espátula.
___Conecte la parrilla magnética.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % sobre la parrilla magnética.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso bicarbonato 10 %.
___Con la probeta graduada mida 90 ml de agua destilada.
___Agregue los 90 ml de agua destilada al vaso bicarbonato 10 %.
___Agite vigorosamente para homogeneizar el bicarbonato de sodio.
___Apague la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador del vaso bicarbonato 10 %.
___Enjuague el espátula y el agitador magnético con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.
___Tome un vaso de precipitados de 50 ml.
___Etiquete el vaso de 50 ml con el nombre hidróxido de sodio 0.1 N.
___Ajuste la balanza a 0.0 g.
___Coloque el vaso hidróxido de sodio 0.1 N sobre la balanza.
___Tare el vaso hidróxido de sodio 0.1 N.
___Tome un espátula.
___Destape el frasco de hidróxido de sodio.
___Pese _____ g de hidróxido de sodio en el vaso hidróxido de sodio 0.1 N.
___Tape el frasco de hidróxido de sodio.
___Lave el espátula con agua destilada.
___Seque el espátula con la franela.
___Coloque el vaso hidróxido de sodio 0.1 N sobre la parrilla.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso hidróxido de sodio 0.1 N.
___Con la probeta graduada mida 20 ml de agua destilada.
___Agregue los 20 ml de agua destilada al vaso hidróxido de sodio 0.1 N.
___Agite vigorosamente para disolver el hidróxido de sodio.
___Apague la parrilla magnética.
___Retire el vaso hidróxido de sodio 0.1 N de la parrilla.
___Con el espátula retire el agitador del vaso hidróxido de sodio.
___Enjuague el espátula y el agitador magnético con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.
___Tome un matraz volumétrico de 25 ml.
___Etiquete el matraz volumétrico de 25 ml con el nombre hidróxido de sodio.
___Vierta la solución de hidróxido de sodio en el matraz hidróxido de sodio.
___Afore con agua destilada el matraz volumétrico hidróxido de sodio.
___Tape y agite el matraz volumétrico de 25 ml hidróxido de sodio.
___Vierta la solución de hidróxido de sodio en el vaso hidróxido de sodio 0.1 N.
___Enjuague y lave el matraz volumétrico de 25 ml hidróxido de sodio.

___Tome un vaso de precipitados de 50 ml.
___Etiquete el vaso de 50 ml con el nombre ácido clorhídrico 0.1 N.
___Con la probeta graduada mida 20 ml de agua destilada.
___Agregue los 20 ml de agua destilada al vaso ácido clorhídrico 0.1 N.
___Colóquese el respirador.
___Coloque dentro de la campana el vaso ácido clorhídrico 0.1 N.
___Coloque el vaso bicarbonato 10 % en la campana de extracción.
___Encienda la campana de extracción.
___Tome una pipeta serológica de 5 ml.
___Moje ligeramente el exterior de la boca de la pipeta serológica de 5 ml.
___Tome una propipeta.
___Inserte la boca de la pipeta serológica de 5 ml en la propipeta.
___Haga presión negativa en la propipeta.
___Destape el frasco de ácido clorhídrico.
___Dentro de la campana, mida _____ ml de ácido clorhídrico con la pipeta de 5 ml.
___Dentro de la campana, deslice el ácido clorhídrico en el vaso ácido clorhídrico 0.1 N.
___Tape el frasco de ácido clorhídrico.
___Enjuague la pipeta serológica de 5 ml con agua corriente.
___Retire la pipeta serológica de la propipeta.
___Iguale las presiones en la propipeta.
___Coloque el vaso ácido clorhídrico 0.1 N sobre la parrilla.
___Introduzca el agitador magnético en el vaso ácido clorhídrico 0.1 N.
___Agite gentilmente para disolver el ácido clorhídrico.
___Apague la parrilla magnética.
___Retire el vaso ácido clorhídrico 0.1 N de la parrilla magnética.
___Con el espátula retire el agitador del vaso ácido clorhídrico 0.1 N.
___Enjuague el espátula y el agitador magnético con agua destilada.
___Seque el espátula y el agitador magnético.
___Tome un matraz volumétrico de 25 ml.
___Etiquete el matraz volumétrico de 25 ml con el nombre ácido clorhídrico 0.1 N.
___Vierta la solución de ácido clorhídrico en el matraz ácido clorhídrico 0.1 N.
___Afore con agua destilada el matraz volumétrico ácido clorhídrico 0.1 N.
___Tape y agite el matraz volumétrico ácido clorhídrico 0.1 N.
___Vierta la solución de ácido clorhídrico 0.1 N en el vaso ácido clorhídrico 0.1 N.
___Enjuague y lave el matraz volumétrico ácido clorhídrico 0.1 N.
Desnaturalización de la enzima
___Pele y rebane en 6 rebanadas transversales el kiwi.
___Homogeneice por separado cada rebanada de kiwi en el mortero.
___Vierta el homogeneizado de cada rebanada en sendos vasos de 100ml.
___A un vaso de homogeneizado agregue 1 ml de HCl 0.1 N y etiquételo.
___A un vaso de homogeneizado agregue 1 ml de NaOH 0.1 N y etiquételo.
___A un vaso de homogeneizado agregue 1 ml de agua destilada, etiquételo y hierva por 5 min..
___Corte el limón a la mitad.
___A un vaso de 100 ml agregue el jugo de un limón y etiquételo.
___A un vaso de 100 ml agregue el jugo de un limón ,etiquételo y hierva por 5 min.
Preparación de la gelatina
___Vierta la gelatina en un vaso de precipitados de 500 ml.
___Agregue 100 ml de agua destilada fría.
___Revuelva la gelatina en agua fría
___Deje reposar la suspensión de gelatina uno o dos minutos.
___Añada a la suspensión de gelatina el agua hirviendo
___Revuelva hasta que la gelatina se disuelva.
___Coloque por separado las bases y tapas de las cinco cajas de Petri.
___Rotule las bases y tapas de las cinco cajas de Petri del No 1 al 10.
___Vierta 9 ml de gelatina en cada base y en cada tapa de las cinco cajas de Petri.
___La caja No. 1 se mantiene como control.
___En la caja No. 2 se agrega 1 ml de HCl 0.1N y se homogeneiza.
___En la caja No. 3 se agrega 1 ml de NaOH 0.1N y se homogeneiza.
___En la caja No. 4 se agrega 1 ml de jugo de limón fresco y se homogeneiza.
___En la caja No. 5 se agrega 1 ml de jugo de limón hervido y se homogeneiza.
___En la caja No. 6 se agrega 1 ml de jugo de kiwi fresco y se homogeneiza.
___En la caja No. 7 se agrega 1 ml de jugo de kiwi hervido y se homogeneiza.
___En la caja No. 8 se agrega 1 ml de jugo de kiwi ácido y se homogeneiza.
___En la caja No. 9 se agrega 1 ml de jugo de kiwi alcalino y se homogeneiza.
___En la caja No. 10 se agrega 1 ml de n-butanol y se homogeneiza.
___Guarde todas las cajas en el refrigerador.
___Espere una hora para que cuaje la gelatina control y compare.
Determinación de proteína
___Repita la curva de calibración de proteína vs Absorbencia del experimento 4.
___Determine la concentración de proteína en 1 ml de jugo de kiwi fresco.
___Determine la concentración de proteína en 1 ml de jugo de limón fresco.
___Desarrolle color en los problemas y fracciones anteriores para leer en colorímetro del mismo modo realizado en el experimento 4.



___Agite después de la adición de cada reactivo.
___Repose 30 min a Temperatura ambiente ( ___ ) para desarrollar color.
___Lea la Absorbencia A a 540 nm en celdas de 1 cm de diámetro.
Forma de desechar
___Neutralice lentamente los residuos ácidos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos ácidos (ver Forma de desechar).
___Neutralice lentamente los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos orgánicos(ver Forma de desechar).
___Lave y enjuague el material.
___Seque el material con papel o con franela.
___Guarde y entregue el material y los equipos.
___Revise que no haya reactivos en la campana.
___Apague la campana de extracción.
___Revise que no haya reactivos sobre la mesa.
___Revise que la mesa esté limpia y seca.
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los extractores de aire estén apagados.
___Revise que los interruptores eléctricos del laboratorio estén apagados.
___Retírese el equipo de protección personal.
___Guarde el equipo de protección personal.
___Revise que la luz del laboratorio esté apagada.

Forma de desechar.
___Neutralice los residuos ácidos con bicarbonato de sodio. Deseche.
___Neutralice los residuos alcalinos con bicarbonato de sodio. Deseche.

OBSERVACIONES
___Tabule los datos de concentración (mg de proteína/ml) vs Absorbencia (A).
___Trace la curva patrón (colocando la variable independiente en las abcisas y la dependiente en las ordenadas).
___Interpole los datos de los problemas en la curva patrón.
___Calcule los resultados de sus problemas, dando los valores en miligramos de proteína, tomando en cuenta alícuotas y diluciones.
___Tabule sus resultados anotando las unidades correspondientes.
___Compare el efecto de los jugos entre sí y con el HCl y el NaOH.
___Compare el efecto de el HCl y el NaOH sobre la gelatina y sobre el jugo de kiwi.

REFERENCIAS.
Mandell, M. 1993. Simple Kitchen Experiments. Sterling Publ. Co., New York.
Plumer, D.T. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill.
Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica Aplicada. Editorial Interamericana.

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© Raúl Alva*, México, 5/III/2001.
*Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México.