Cuantificación de proteína



OBJETIVO.

Objetivo didáctico.
Practivar un método colorimétrico para cuantificar proteínas. Practicar la colorimetría como ejemplo de aplicación de la espectrofotometría en estudios bioquímicos.

Objetivo experimental. Medir la absorción de luz por muestras de proteínas para determinar la cantidad de caseína obtenida a partir de una muestra de leche.

INTRODUCCION.
Colorimetría.

Determinación cuantitativa de proteínas mediante el método de Biuret.

Este método es sencillo, pero su sensibilidad está dentro de un rango de concentración del orden de miligramos.

MATERIALES Y EQUIPOS.

___Agitador magnético 1
___Botella lavadora con agua destilada 1
___Celdas cilíndricas de vidrio de 5 ml 2
___Colorímetro 1
___Espátula 1
___Gradilla 1
___Matraz volumétrico de 50 ml 1
___Parrilla magnética 1
___Pipetas serológicas de 10 ml 2
___Pipetas serológicas de 5 ml 2
___Pipetas serológicas de 1 ml 4
___Vaso de precipitados de 100 ml 2
___Termómetro -10 a 200 °C 1
___Tubos de ensayo de 20 x 150 mm 15
___Gradilla 1

REACTIVOS Y SUSTANCIAS.

___Bicarbonato de sodio 10 %.
___Solución patrón de caseína: 10 mg/ml.
___Si es necesario, agregue solución concentrada de NaOH para disolver.

___Reactivo de Biuret: 1.5 g de sulfato cúprico penta-hidratado
___ 6.0 g de tartrato doble de Na y K tetra-hidratado.
___Forma de preparar: Disolver en 500 ml de agua destilada.
___ Agregar 300 ml de solución de NaOH al 10% libre de carbonatos.
___ Aforar a 1000 ml.

PROCEDIMIENTO.

Equipo de protección.
Ojos.
___Anteojos de policarbonato o monogógles.

Piel.
___Guantes de látex.
___Ropa de algodón.

Respiratorio.
___No se requiere protección especial.

Precauciones especiales.
___Baño de ojos disponible.
___Regadera de seguridad disponible.
___Extinguidor de polvo químico, CO2 o gas halón (Tipo ABC).
___Lave abundantemente después de usar los reactivos.

Experimento.
___Colóquese ropa de algodón para protección (bata).
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los interruptores de luz del laboratorio estén encendidos.
___Revise que los extractores de aire estén encendidos.
Preparación de soluciones.
___Revise que el Agua destilada esté sobre la mesa.
___Revise que el Bicarbonato de sodio esté sobre la mesa.
___Revise que el Hidróxido de sodio esté sobre la mesa.
___Revise que el Sulfato cúprico esté sobre la mesa.
___Revise que el Tartrato de sodio y potasio esté sobre la mesa.
___Colóquese los guantes de látex.
___Lave el material con agua corriente y detergente.
___Enjuague el material con agua destilada.
___Seque el material con franela o con papel absorbente.
___Seque los guantes de látex con franela o con papel absorbente.
___Colóquese anteojos de policarbonato o monogógles.
___Prepare la solución de la caseína obtenida a una concentración de 4 mg/lm
___(debe estar libre de grandes cantidades de amoniaco).
___Pese 200 mg de caseína en un vaso de precipitados de 100 ml.
___Añada 30 ml de una solución de NaCl al 1 %.
___Agregue gota a gota solución concentrada de NaOH hasta disolver totalmente.
___Vierta la solución anterior a un matraz aforado de 50 ml
___Afore con agua.
___Esta es la solución problema y de ella se tomarán alícuotas.
___Determinela concentración de proteína en las siguientes fracciones:
___1 ml del Sobrenadante obtenido en el paso A3
___1 ml de la leche diluída 1:4 del paso Al.
___Desarrolle color en los problemas y fracciones anteriores para leer en colorímetro de acuerdo a cuadro siguiente



___Agite después de la adición de cada reactivo.
___Repose 30 min a Temperatura ambiente ( ___ ) para desarrollar color.
___Lea la Absorbencia A a 540 nm en celdas de 1 cm de diámetro.
Forma de desechar
___Neutralice lentamente los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos básicos (ver Forma de desechar).
___Deseche los residuos orgánicos(ver Forma de desechar).
___Lave y enjuague el material.
___Seque el material con papel o con franela.
___Guarde y entregue el material y los equipos.
___Revise que no haya reactivos en la campana.
___Apague la campana de extracción.
___Revise que no haya reactivos sobre la mesa.
___Revise que la mesa esté limpia y seca.
___Revise que las llaves de gas estén cerradas.
___Revise que las llaves de agua estén cerradas.
___Revise que las llaves de aire comprimido estén cerradas.
___Revise que los contactos eléctricos estén libres.
___Revise que los extractores de aire estén apagados.
___Revise que los interruptores eléctricos del laboratorio estén apagados.
___Retírese el equipo de protección personal.
___Guarde el equipo de protección personal.
___Revise que la luz del laboratorio esté apagada.

Forma de desechar.
___Neutralice los residuos alcalinos con bicarbonato de sodio. Deseche.

OBSERVACIONES
___Tabule los datos de concentración (mg de proteína/ml) vs Absorbencia (A).
___Trace la curva patrón (colocando la variable independiente en las abcisas y la dependiente en las ordenadas).
___Interpole los datos de los problemas en la curva patrón.
___Calcule los resultados de sus problemas, dando los valores en miligramos de proteína, tomando en cuenta alícuotas y diluciones.
___Tabule sus resultados anotando las unidades correspondientes.
___Calcule el rendimiento y la pureza de la caseína obtenida.

REFERENCIAS.
Plumer, D.T. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill.
Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica Aplicada. Editorial lnteramerícana.

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© Raúl Alva*, México, 5/III/2001.
*Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México.