HACIA UN MODELO PREDICTIVO DEL COMPORTAMIENTO DE LOS ACARREADORES ANTIPARALELOS. Una interpretación.

Con base en las evidencias presentadas en colaboración con Toro (1987) que sugerían que el antibiótico poliéter monocarboxílico nigericina posee la capacidad de interactuar con cationes metálicos a los cuales no transporta, aunado al aumento de la estabilidad del complejo cuando el ionóforo esta protonado, se decidió emprender un análisis más ambicioso en la búsqueda de los patrones fisicoquímicos que regulan la interacción poliéter-metal, para tratar de correlacionarlos con la actividad ionoforética de esta familia de antibióticos. Por tal motivo, se comenzó por verificar la formación de complejos catiónicos polivalentes con otros poliéteres carboxílicos de la familia de la nigericina.

Es probable, con estos antecedentes, que los ionóforos carboxílicos "monovalentes" -como la monensina y la nigericina- puedan coordinar, y tal vez translocar, Ca²⁺ u otros cationes alcalintérreos, en condiciones de pH, polaridad, hidrofobicidad y capacidad dieléctrica ambientales apropiadas.

En la Tabla 3.5 se muestran los valores de las constantes de estabilidad (log Ks) calculados para los complejos de nigericina, monensina y lasalócido A con cationes de metales alcalinos, con Ca²⁺ y con Pr³⁺, a pH = pKa y e_r 38.48. En estas condiciones experimentales el 50 % del ácido libre de cada poliéter se encuentra ionizado a -COO^- y la unión de la molécula al catión se ve favorecida por la presencia equivalente de las dos especies que se han descrito para la formación de los complejos poliéter-catión (Pressman, 1968; Toro y cols., 1987). Es importante mencionar el hecho de que el registro del pH en el vaso de reacción no mostró una acidificación significativa del medio cuando la concentración de metal aumenta durante la formación del complejo, lo que confirma que el catión -cualquiera que éste sea- no desplaza al protón, por lo que el poliéter permanece prácticamente sin disociar dentro del complejo de coordinación (Toro y cols., 1987).

Los valores de desviación estándar de los log Ks obtenidos sugieren que, en el caso de cada poliéter carboxílico, no existe diferencia significativa entre las Ks -en una sola fase homogénea- de los complejos estudiados por medio de técnicas potenciométricas. Esto sugiere que la probabilidad de que cada poliéter forme clatratos con los cationes alcalinos es similar, independientemente de que éstos sean translocados a través de membranas lipídicas.

Los DG° de la reacción de formación de los complejos de nigericina y lasalócido A con cationes alcalinos (Tabla 3.6), calculados a partir de los resultados de log Ks, confirman la factibilidad termodinámica de la formación de los complejos antes mencionados; sin embargo, los valores de DG° estimados para el lasalócido A, son entre cuatro y cinco veces menores que los obtenidos para nigericina, lo que sugiere una menor afinidad del poliéter lasalócido A por dichos cationes en las condiciones experimentales estudiadas. Los resultados de formación de complejos aquí obtenidos no se correlacionan estrechamente con las curvas y secuencias de selectividad de complejación y transporte catiónico publicadas para nigericina y lasalócido A, en diferentes sistemas experimentales (Tabla 3.3), ni con ningún otro parámetro estudiado con anterioridad en la formación de complejos de estos poliéteres carboxílicos con cationes metálicos (Taylor y cols., 1982). El hallazgo de que no existen diferencias significativas entre los valores de Ks, claramente indica que cada poliéter pueden formar complejos de demandas energéticas equivalentes con los metales alcalinos, sin relación con su capacidad para transportarlos. Así, los requerimientos energéticos de la reacción de complejación parecen no ser el paso limitante del proceso de transporte y, por lo tanto, no son responsables de la selectividad observada en sistemas multifásicos, tales como tubos en "U" y membranas lipídicas. También parece ser que no existe relación entre la estabilidad del complejo y el tamaño del catión (por ejemplo, los radios iónico, atómico o hidratado) ni con la electronegatividad. Por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la nigericina y el lasalócido A son capaces de formar complejos virtualmente con cualquier catión metálico, sin importar el tamaño iónico.

A diferencia de lo que se encontró con los poliéteres nigericina y lasalócido A, la monensina muestra un comportamiento de estabilidad catiónica (Tabla 3.5) similar a los resultados de experimentos de transporte publicados previamente (Tabla 3.3). A partir de sus valores de log Ks y de las estimaciones de DG° con los tres cationes alcalinos estudiados, se observa que forma con el Na⁺ los complejos ligeramente más estables, seguidos por los de Li⁺, habiendo una mayor diferencia con respecto a los de Cs⁺.

Por otra parte, cuando se estudió la estabilidad de los tres poliéteres con los cationes polivalentes Ca²⁺ y Pr³⁺ en solución en una sola fase homogénea, se encontró que los valores de Ks correspondientes fueron, generalmente, muy bajos e independientes del antibiótico ligante (Tabla 3.5). Estos hallazgos sugieren que la formación de los complejos, en las condiciones ensayadas, es termodinámicamente poco favorecida. Las pequeñas Ks, junto con el valor del pH del medio experimental y su relación con el pKa de los ionóforos, parecen indicar que es la química del catión en solución, la que determina la factibilidad de interacción, asociación, coordinación, quelación y, por lo tanto disociación, de los complejos poliéter-catión polivalente. Esta explicación aporta una clara luz sobre el funcionamiento de los ionóforos divalentes y su conocida eficiencia de transporte de Ca²⁺.

El comportamiento de la unión del poliéter nigericina con los cationes alcalinos se siguió por titulación potenciométrica en solución homogénea. Con cada catión alcalino ensayado se observa una aparente reacción de primer orden. Sin embargo, existen diferencias en la tasa de unión del poliéter con los distintos metales. Parece ser que la intensidad de la unión entre el poliéter y el catión determina la rapidez del transporte iónico. Esto se desprende de las diferentes tasas obtenidas a partir de la razón existente entre la concentración de metal unido -o complejo formado- y la de metal total, donde se observan dos patrones generales de comportamiento. Primero, se muestra una mayor tasa de unión con Li⁺ y Cs⁺, lo que sugiere mayores fuerzas de atracción entre estos cationes y el poliéter. Segundo, la menor tasa de unión con los cationes que son transportados sugiere una fácil disociación entre éstos y el acarreador.

La magnitud de la interacción sugiere que el Li⁺ y el Cs⁺ se unen fuertemente a la nigericina, no se disocian fácilmente y, por lo tanto, el ionóforo es incapaz de transportarlos a través de las barreras lipídicas. Así, la disociación puede ser un paso limitante mayor del transporte mediado por acarreadores móviles.

La mayor afinidad e intensidad de interacción de Li⁺ y Cs⁺ mostrada por la nigericina parece relacionarse con la mayor afinidad electrónica (ae) y con los valores de potencial de reducción (E°) de ambos cationes, más que con su tamaño y electronegatividad. Esto se desprende de que los valores de E° de Li⁺ (-3.02 V) y Cs⁺ (-3.02 V) son mayores que los de Na⁺ (-2.71 V), así como a partir de datos que muestran que la ae de Li⁺ (0.58 eV) es menor que la de Na⁺ (aeNa+ 0.78 eV). En consecuencia, las propiedades energéticas intrínsecas de los átomos metálicos pueden jugar un papel central en la selectividad de unión y de transporte iónico. Estos datos complementan evidencias previas que indican que las variaciones en la estructura química de los poliéteres determinan las transiciones de selectividad iónica para el transporte.

De modo inicial, es posible sugerir, que la estabilidad de los complejos, medida como Ks, es proporcional a la carga iónica qi del metal, ya que el log Ks de los complejos monovalentes suele aumentar, aunque sea ligeramente, con la exposición de la carga eléctrica nuclear; esto bien puede explicar lo pequeño de las Ks determinadas para los cationes polivalentes. Segundo, la estabilidad es varios órdenes de magnitud mayor conforme se incrementa el número de átomos ligantes (Q) en la molécula y, por lo mismo, la fuerza de la atracción electrostática polar entre ligante y ligado. Y, tercero, la estabilidad parece disminuir cuando aumenta el radio iónico (ri) del metal ligado. Se puede resumir, este modelo verbal de "quelaticidad", en la expresión preliminar

Ks µ f(qi, Q, ri)

Otros resultados muestran que la monensina, ionóforo selectivo para Na⁺, funciona como ionóforo para transportar K⁺ en condiciones de polaridad y permitividad relativa semejantes a una membrana lipídica. Por su parte, los resultados con Ca²⁺ sugieren que la monensina interactúa con este catión y lo transloca en forma diferencial en función del pH (Hebrant y cols., 1992).

Por otro lado, los resultados de partición de K⁺ y Ca²⁺ mediados por lasalócido A demuestran la mayor flexibilidad de este ionóforo para interactuar y transportar cationes monovalentes.

En el presente trabajo se pone de manifiesto que los antibióticos poliéteres carboxílicos monensina y lasalócido A pueden interactuar con cationes monovalentes, divalentes y trivalentes (Figuras 3.5, 3.6 y 3.7) y translocarlos sin cooperación de otros compuestos (resultados no mostrados), a diferencia de lo publicado en los trabajos previos realizados por Grandjean y Laszlo (1986) sobre transporte de Pr³⁺ en vesículas de fosfatidilcolina. Estos muestran el transporte acelerado del catión Pr³⁺ en presencia del ionóforo lasalócido A y un ácido graso, que por sí solo es incapaz de transportar al lantánido. En otros trabajos realizados por Grandjean y Laszlo (1989) sobre el transporte sinergístico de Pr³⁺ por los ionóforos lasalócido A o monensina, otro ionóforo o un ácido carboxílico está presente en el modelo de membrana (vesículas de fosfatidilcolina). Donis y cols. (1981), mostraron el transporte sinergístico de Pr³⁺ empleando el poliéter eteromicina y un ionóforo sintético, en vesículas de fosfatidilcolina.

Por su configuración electrónica, las moléculas de los poliéteres carboxílicos no tienen bandas de absorción en el espectro visible; en cambio, presentan absorción de radiación en la región del UV lejano, cerca de los 200 nm de logitud de onda. Su espectro electrónico en el UV en solución en etanol suele presentar un pico de absorción máxima a 205 nm, con una disminución pronunciada de e hasta los 220 nm; a partir de esta l, pocos antibióticos poliéteres presentan absorción electrónica.

Estas características espectroscópicas parecen ser comunes dentro de la familia de los antibióticos poliéteres carboxílicos. Por ejemplo, al obtener el espectro de absorción en el UV de la monensina en etanol, éste presenta un pico máximo de absorbencia alrededor de una l de 215 nm (Figura 3.5).

Algo notable en la absorción electrónica de esta familia de moléculas es que, al menos en el caso de la monensina y la nigericina, no se encuentra linealidad de la ley de Lambert-Beer en ninguna región del UV en el intervalo de concentraciones de poliéter que van del orden micromolar al milimolar, por lo que no es posible hacer determinaciones directas de la concentración de poliéter por métodos de espectroscopía UV/VIS. Además, los espectros de ambas moléculas presentan corrimientos en la l de máxima absorbencia, tanto hacia el rojo como hacia el violeta, los cuales no se correlacionan con la concentración del poliéter (resultados no mostrados).

Los resultados muestran que la absorción en UV de la monensina en sus diferentes formas, tiene una región de máxima absorbencia entre 206 y 208 nm; esto se puede apreciar en las formas de sal de Na⁺, complejo con Na⁺, Li⁺ y Ca²⁺. Existe la extinción de este pico en el ácido libre y aparece un hombro a 227 nm en esta forma; entonces, hay una marcada influencia en la monensina al estar presente un catión metálico.

Otro aspecto importante que sugieren estos resultados es que, al aumentar el número de orbitales atómicos (ambiente electrónico), existe un ensanchamiento del pico de absorción máxima, hasta definirse como un gran hombro de absorción. Además, algo que puede estar estrechamente relacionado con lo anterior es la manifestación de un marcado efecto hipercrómico en el complejo Pr³⁺.

Las especies monoméricas parecen ser estructuras con forma de gancho cerrado de la cabeza a la cola, estabilizadas por puentes H entre los grupos hidroxilo y carboxilo terminales (Alpha y Brady, 1973; Degani y Friedman, 1973). Tales estructuras conformacionales son congruentes con el aumento de la transición p ® p* del salicilato a 245 nm (Painter y Pressman, 1980), causada tanto por la unión de Na⁺ como por el solvente no polar. La inversión del efecto Cotton del ácido libre del lasalócido A a 215 nm inducida por el n-hexano, que puede atribuirse a la transición n ® p* del grupo carboxilo (Crabbé, 1972), confirma el ciclado del poliéter a través de un puente H de la cabeza a la cola.

Los confórmeros de gancho cerrado del complejo de Na⁺ y de la sal de sodio se refuerzan por el solvente no polar, y disminuyen la longitud del puente H entre los extremos terminales del lasalócido; esta última observación está de acuerdo con el fuerte efecto Cotton negativo que se exhibe a 215 nm. Además, las elipticidades del complejo y de la sal de sodio establecen diferencias pequeñas entre ambas muestras, que dependen de la ionización del carboxilo. Asimismo, el aumento de la [q] de l3, que en parte es causada por la transición cetónica n ® p*, sugiere una contribución importante del oxígeno del carbonilo a la estabilización del gancho cerrado en la sal de Na⁺ del lasalócido A.

El aumento de l1 y l2 también se lleva a cabo en la solución etanólica del lasalócido A ácido en presencia de K⁺ y Rb⁺, lo que sugiere una fuerte perturbación de los grupos carboxilo y aromático del salicilato, en contraste con los grupos carbonilo. El arreglo estructural que mejor se ajusta, es aquél en el que los ganchos cerrados de ionóforo se apilan alternados con el catión en proporción 3:2, en "emparedados" de tipo "Big Mac". Tal conformación de "emparedado" se ha descrito para complejos de Ca²⁺ con ionóforos ciclopéptidos (Ivanov, 1975) así como con lasalócido A (Célis y cols., 1974), y se valida para éste último, en este trabajo, con una estequiometría poliéter:catión de 2:1.

Es notable que el grupo carboxilo salicílico controla de forma diferencial la unión del catión. Esto se infiere del análisis de la transición n ® p* del carboxilo, que también puede surgir de contribuciones de transferencia de carga (Harada y Nakanishi, 1968). El hecho de que la [q] de la banda l1 del ácido lasalócido A sea severamente invertida por K⁺ y Rb⁺, junto con los corrimientos al azul en el UV en etanol, sugiere que estos iones inducen la polarización del grupo carboxilo salicílico. La configuración adquirida por cada complejo no sufre modificaciones importantes por su disolución en n-hexano, no polar.

Por otro lado, en presencia de Li⁺ los complejos se pueden agregar en oligómeros de proporción 3:1. El comportamiento del DC en etanol sugiere que el lasalócido A ácido une al Li⁺ principalmente por medio del oxígeno del carbonilo, seguido por los oxígenos del grupo salicílico. Se supone que la conformación del complejo lasalócido A-Li⁺ difiere de forma significativa de la adquirida con los otros cationes alcalinos.

El pequeño radio iónico del Li⁺ proporciona una alta energía de hidratación a este catión alcalino, lo que induce una fuerte interacción con los átomos de oxígeno (Cotton y Wilkinson, 1966). En estos términos, el Li⁺ incita a los oxígenos del lasalócido a rodear el perímetro iónico, y da origen a la alta relación molécula:catión observada. El modelo de esta conformación se representa por un arreglo de "criptando" o cesta, en la que el Li⁺ estabiliza a dicha estructura.

Por otro lado, esta interacción se modifica ligeramente cuando el complejo se disuelve en n-hexano, donde el grupo fenilo contribuye en mayor parte a la unión del catión, supuestamente a través del grupo hidroxilo. La presión extra que se dirige hacia el interior, ejercida por la disolución del complejo de Li⁺ en el n-hexano no polar, parece expulsar al grupo carboxilo salicílico de la parte central del complejo, hacia el solvente.

La conformación del complejo lasalócido A-Pr³⁺ ha sido objeto de varios estudios. Existen reportes de relaciones estequiométricas poliéter:catión de 1:1 (Richardson y Dasgupta, 1982; Shastri y cols., 1987b), 2:1 (Fernández y cols., 1973) y 3:1 (Chen y cols., 1978). Los resultados obtenidos en este estudio apoyan la versión de la forma trimérica. La imagen estructural del lasalócido A-Pr³⁺ en etanol es, en general, similar a aquella del complejo lasalócido A-Li⁺, es decir, una canasta o criptando de tres asas. Sin embargo, existen diferencias en la contribución del anillo fenílico. Los datos de DC en etanol, junto con la poca solubilidad del complejo en n-hexano, sugieren que el grupo carboxilo está expuesto hacia el entorno, y ofrece un exterior ligeramente polar e hidrofílico. De cualquier modo, de acuerdo con la observada capacidad de transporte a través de bicapas lipídicas (Estrada O. y cols., 1974b; Fernández y cols., 1973; Chen y Springer, 1978; Richardson y Dasgupta, 1982; Everett y cols., 1983; Shastri y cols., 1987a), el catión Pr³⁺ está completamente encapsulado.

Finalmente, como se mencionó arriba, el lasalócido A ácido forma complejos de "emparedados sencillos" con Ca²⁺. Cuando este complejo se disuelve en etanol, el ion Ca²⁺ parece estar unido principalmente por medio del oxígeno cetónico, seguido por los oxígenos del fenilo y del carboxilo. Por otro lado, el Ca²⁺ no modifica en gran medida la conformación de gancho cerrado del ácido lasalócido A en n-hexano.

Ji µ f(pH½, pKa, ai, aei, E°i, ri, qi, [A]m, FA, µA, Ks, CpL, DL, µm, Kd)

El valor del pH microambiental adyacente a la membrana (pH½) afecta la disociación del grupo carboxilo del poliéter, lo que depende de su constante de acidez (pKa); la información existente sugiere que la molécula protonada es más afín que la aniónica por el metal (Toro y cols., 1987). La alta concentración química del catión (ai) induce su unión a la molécula ligante en la interfase membrana-agua; ésta depende de factores intrínsecos del metal, como su afinidad electrónica (aei), potencial de reducción (E°i), radio (ri) y carga iónicas (qi). Si, a su vez, la concentración del acarreador en la membrana ([A]m) es suficiente, es posible que varias moléculas se aglomeren (Toro y cols., 1976; Toro y cols., 1987; Ballardini y cols., 1992; Chattopadhyay y cols., 1992; Lyazghi y cols., 1992d), en función de su flexibilidad (FA) y polaridad (µA), alrededor del catión en función del pH interfasial originando un oligómero conductor. Una vez formado el complejo poliéter-metal, lo que depende de su estabilidad (Ks), éste debe solubilizarse (Maxwell y cols., 1992) en la fase orgánica (CpL) para poder difundir (DL), a favor del gradiente químico del catión, a través de las cadenas lipídicas de la matriz hasta el otro extremo de la membrana; en este caso es importante la polaridad del medio membranal (µm). Cuando el complejo se encuentra en la interfase, la molécula se disocia (Kd) del catión que se solubiliza en el medio acuoso. Así, el poliéter libre difunde de vuelta para completar un ciclo de transporte.

Las diferencias espectrales observadas y las relaciones estequiométricas obtenidas, hacen evidentes los cambios que sufren los poliéteres monensina y lasalócido A en función del catión unido y del ambiente en que se encuentran. Sugieren que la presencia de diferentes cationes inducen cambios estructurales en las moléculas al formar complejos con Na⁺, Li⁺, Ca²⁺ y Pr³⁺ en experimentos en una sola fase líquida.

© Raúl Alva*, México, Agosto de 1995.
*Profesor-Investigador de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, México.