Javier Torres Rodríguez, Fundamentos en la Biología Aplicada (I).
TÉCNICAS MOLECULARES DE ANÁLISIS GENÉTICO.
AISLAMIENTO Y CLONACION DE ADN SATÉLITE.
Universidad de Granada.
Departamento de Genética.
1. Introducción:
El objetivo de la práctica es, a partir de una muestra biológica de esturión, (Acipensis naccarii), aislar el ADN satélite, y proceder posteriormente a la clonación de la secuencia. Para esto, es necesario aplicar una serie de protocolos de laboratorio ordenados, ademas se hace necesario la utilización de organismos procariotas, bacterias donde insertaremos los plásmidos ya diseñados, para que en ellas se replique.
El organismo propicio para esto es Escherichia coli, la cepa DH5-(alfa).
Se hace necesario el introducir en el plásmido un gen resistente a ampicilina, de esta forma, logramos discriminar las bacterias que tienen, que han logrado incorporar el plásmido de las que no, las que no posean el plásmido, tras el cultivo aparecerán azules, mientras que las que si incorporaron nuestro plásmido, tras el cultivo aparecen colonias blancas.
2. Metodología y fundamento:
2.1. Digestión del ADN.
En primer lugar, tenemos que digerir el ADN genómico del esturión, para ello aplicamos las cantidades que marca el protocolo, evidentemente necesitaremos una enzima especifica para ello, HindIII, esta enzima cortará el ADN en muchos fragmentos de diferentes tamaños, y siempre por zonas especificas del genoma.
2.2. Digestión del Plásmido.
También en un microtubo, necesitamos cortar los plásmidos por sitios específicos, utilizamos ademas de tampón de restricción y agua destilada, la misma enzima con la que digeríamos el ADN del esturión, la HindIII. Como sabemos este tipo de enzimas, son las encargadas de cortar, romper la cadena de ADN de forma especifica, por secuencias determinadas.
2.3. Utilización de geles de agarosa. Electroforesis.
Necesitamos, por una parte hacer un gel de agarosa, de bajo punto de fusión, aplicamos el protocolo pertinente, dejamos enfriar hasta los 50 grados aproximadamente, sellamos, colocamos el peine ( es una estructura que simplemente hará unos huecos en el gel donde luego cargaremos las muestras para iniciar la migración). Retirado el peine y frío el gel, lo cubrimos con tampón de recorrido (TAE), Ya con el gel en la cubeta, nos queda cargar las muestras, con el ADN que digerimos en los pasos anteriores, antes necesitamos tampón de carga, que se mezcla en los tubos que contienen el material genético, ayudados de una micro pipeta, y con extremo cuidado de no romper el gel lo añadimos, ya solo nos queda conectar la cubeta a una fuente de alimentación y esperar a que el ADN corra por "las calles" del gel.
A continuación hay que utilizar un transiluminador ultravioleta para poder ver los rastros del ADN, lo que se aprecia, son bandas, fluorescentes con zonas especificas mas luminiscentes, esta luminiscencia se la da el bromuro de etidio, esta sustancia tiene la peculiaridad que es capaz de insertarse entre las bases del ADN, y absorber luz ultravioleta, es de color anaranjado cuando se le aplica esta luz con esta longitud de onda.
2.4. Purificación del Gel.
A partir de este momento, tenemos que cortar el gel exactamente por la banda que nos interesa, es decir por el sitio especifico donde esta el ADN monomérico satélite, se toma con una cuchilla y se pasa a un tubo, tendremos entonces ya el ADN pero mezclado con el gel, y evidentemente necesitamos eliminar este gel, ya que necesitamos solo el material genético libre de cualquier otra sustancia.
Para lograr esto tenemos que, de forma ordenada hacer una serie de pasos para obtener el ADN limpio, se funde la agarosa en un baño a 60 grados y ayudado por una sustancia solubilizada, mezclar todo, añadirle una resina especifica, esta resina( Sephaglass-BP) tiene la propiedad de secuestrar el material genético y quitarle el ADN a la agarosa, tras un centrifugado a 12.000 rpp, durante un minuto obtenemos un precipitado que es la resina con el ADN, eliminamos entonces el sobrenadante, y nos quedamos con ese pequeño precipitado, repetimos esto dos veces mas este proceso para asegurarnos la total liberación del ADN con el gel de agarosa. Finalmente dejamos secar la muestra durante 15 minutos.
A continuación debemos de liberar la resina del ADN, para esto, añadimos tampón de dilución, mezclamos bien, incubamos a temperatura ambiente y centrifugamos, hay que tener cuidado con este paso, pues al contrario que el anterior ahora es el sobrenadante lo que tenemos que recuperar, por lo que con una micropiteta se recupera en un microtubo limpio y es el precipitado, la resina lo que tenemos que descartar.
2.4 Ligación:
Ahora, es el momento de unir, ligar los fragmentos del ADN meterlos en un plásmido especifico que posteriormente meteremos en células procariotas en E. Coli, para esto que estamos hablando se hace necesario digerir el plásmido en cuestión con pUC19 previamente digerido con la enzima ya conocida por nosotros HindIII.
2.5 Transformación:
Cuando hablamos de transformación nos referimos al proceso en el cual deberemos de introducir los plásmidos nuestros, los plásmidos construidos en células competentes procariotas, utilizaremos Escherichia coli una cepa DH5-(alfa) apropiada para este fin.
Después de todos los pasos que dicta el protocolo, y tras someter a un choque térmico las bacterias para facilitar así la captación del material genético, ya podemos sembrarlas en un medio rico en ampicilina, tras la siembra como ya comentamos anteriormente encontraremos dos posibilidades, bien colonias azules es señal de que esas bacterias no han incorporado el plásmido, el color azul viene de la dinámica del gen lac-z, codifica para la (beta)-galactosidasa, y degrada del medio lactosa. En realidad, los colores nos sirven para diferenciar claramente que bacterias han incorporado el ADN, (colonias blancas) de aquellas que no lo han incorporado (colonias azules).
